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1、请提出你认为的质粒DNA提取实验中的三个注意事项,说明原因。
参考答案和解析
质粒DNA提取的方法包括碱裂解法、煮沸裂解法和SDS裂解法。
碱裂解法:在NaOH存在的强碱性(pH12.0~14.0)的条件下,用强阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁和裂解细胞,并使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性,释放出质粒DNA。它是一种适用范围很广的方法,能从所有的大肠杆菌(E.coli)菌株中分离出质粒DNA,制备量可大可小。
煮沸裂解法:是将细菌悬浮于含Triton X-100和溶菌酶的缓冲液中,Triton X-100和溶菌酶能破坏细胞壁,再用沸水浴裂解细胞,使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性。对CCC质粒DNA因结构紧密不会解链,当温度下降后,CCC质粒DNA可重新回复其超螺旋结构,通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA,然后回收上清液中的质粒DNA。本法只能用于小质粒DNA(小于15kb)的小量或大量制备,适用于大多数从大肠杆菌(E.coli)菌株中分离出质粒DNA。
S.DS裂解法:它是将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中,用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁,再用SDS裂解去壁细菌,从而温和地释放出质粒DNA到等渗溶液中,然后用酚/氯仿抽提。适用于大质粒DNA的提取。
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考题
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考题
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